Identificação de moduladores da sinalização celular no câncer de cólon e metástases hepáticas como ferramenta para descoberta de alvos terapêuticos / Identification of cell signaling modulators in colon cancer and liver metastases as a tool for discovering therapeutic targets

O câncer de cólon é uma das principais causas de morte por câncer em todo mundo e aproximadamente 50% dos pacientes desenvolvem metástases hepáticas durante o curso da doença. Ainda que a ressecção cirúrgica proporcione sobrevida de 5 anos ao redor de 40%, a maior parte dos pacientes apresenta doença irressecável ao diagnóstico. Neste caso, o cenário é devastador devido à resistência das células tumorais ao tratamento padrão com quimioterapia e/ou anticorpo monoclonal. Apesar dos avanços alcançados pelo rastreamento genômico das metástases, o conhecimento sobre o envolvimento de transcritos e proteínas específicas na atividade de sinalização e recrutamento de populações imunes ainda é limitado nessa doença. Considerando o grande potencial de descoberta e inovação que pode ser alcançado, este projeto propôs o desenvolvimento de uma meta-análise de dados públicos para a exploração de metástases hepáticas e a caracterização proteômica de metástases hepáticas inicialmente irressecáveis em busca de alvos promissores que possam ser explorados em novas opções terapêuticas. As principais etapas metodológicas incluem (1) desenvolvimento de um modelo de integração de dados para a obtenção, processamento e análise de aproximadamente 3.5 mil amostras de RNA-seq, microarray e proteômica de metástases hepáticas inicialmente ressecáveis, tumores primários do cólon e tecidos não-neoplásicos, (2) rastreamento por espectrometria de massas de 30 biópsias pareadas, sendo 15 de metástases hepáticas inicialmente irressecáveis e 15 de tecidos não-neoplásicos adjacentes, (3) investigação de potenciais moduladores da sinalização oncogênica associada à resistência à terapia e (4) exploração dos resultados em um conjunto independente com aproximadamente 138 mil células obtidas por single-cell RNA-seq em busca de associações entre alvos, vias de sinalização e populações imunes. Após a análise de espectrometria de massas e integração de dados da metaanálise, das 46 proteínas diferencialmente reguladas entre metástases hepáticas inicialmente irressecáveis e tecidos não-neoplásicos, TGFB1, CDH2, APOA1, TNFR2, EGFR, MDH2, ITIH2, YWHAZ, PCBP1, TOP2A e ENO1 (todas com aumento de regulação nas metástases) e CXCL14, PLA2G2A e CAV1 (com diminuição de regulação nas metástases) prosseguiram na análise. Dessas, PLA2G2A e CAV1 não foram estatisticamente confirmadas após comparação com cinco estudos independentes. Também foi identificada a ativação nas metástases de importantes vias como JAK-STAT (z-score=3,18), VEGF (z-score=2,67), WNT (z-score=3,22), PI3K (z-score=3,99), MAPK (z-score=2,85), EGFR (z-score=2,49) e NFkB (zscore=4,11). Em seguida observamos pela análise de single-cell RNA-seq que a presença de TGFB1, TNFR2 e EGFR estava associada a maior polarização de neutrófilos e células Tregs em metástases hepáticas, sugerindo uma participação desses alvos no recrutamento dessas populações imunes ou em conjunto durante o desenvolvimento, estabelecimento dessas células no fígado e progressão da doença. Tanto TGFB1 (p=0,01) quanto TNFR2 (p=0,048) foram associados a pior sobrevida global em pacientes metastáticos e apresentaram AUC=0,95 na separação entre câncer primário no cólon e metástases no fígado. Especificamente sobre a comparação entre metástases inicialmente ressecáveis e irressecáveis, apesar de termos identificado alguns alvos com mais de 10-fold de diferença (YWHAZ, AHNAK, HNRNPH1, PCBP1 e TGFB1) apenas TGFB1 prosseguiu em todas as análises, porém, esses resultados sugerem a exploração posterior desses candidatos em novos estudos. Quando buscamos por alvos relacionados à resistência à terapia, nossa estratégia selecionou 32 proteínas diferencialmente reguladas nas metástases resistentes, com envolvimento de CDH2 (p=0,002), CXCL14 (p=0,05), SERPINA1 (p=0,012) e LRGR (p=0,049) com pior sobrevida global em pacientes metastáticos. Nesses tumores também foi observada uma tendência de ativação das vias TGF-ß e TNF-α, já descritas na literatura devido a participação no desenvolvimento e progressão de metástases, além de favorer um perfil de resistência às células tumorais. Por meio de uma análise de deconvolução também observamos maior presença de células Tregs em pacientes resistentes. Essa relação entre Tregs/LGR5 também já foi associada a pior prognóstico em outros tipos de cânceres e suportam uma participação de ambos em um possível mecanismo de resistência desses tumores. Com base nos resultados obtidos, acreditamos oferecer um conjunto de dados inéditos que podem modificar o prognóstico e diagnóstico das metástases hepáticas, bem como contribuir para que os pacientes tenham novas opções terapêuticas com melhora na sobrevida

Colon cancer is one of the leading causes of cancer death worldwide and approximately 50% of patients develop liver metastases during the course of the disease. Although surgical resection provides a 5-year survival rate of around 40%, most patients have unresectable disease at diagnosis. In this case, the scenario is devastating due to the resistance of tumor cells to standard treatment with chemotherapy and/or monoclonal antibody. Despite the advances achieved by genomic tracking of metastases, the involvement of specific transcripts and proteins in the signaling activity and recruitment of immune populations is still limited in this disease. Considering the great potential for discovery and innovation that can be achieved, this project proposed the development of a meta-analysis for the exploration of liver metastases and the proteomic characterization of initially unresectable liver metastases in search of promising targets that can be explored in new therapeutics options. Key methodological steps include (1) development of a data integration model for obtaining, processing and analyzing approximately 3,500 RNA-seq, microarray and proteomic samples from initially resectable liver metastases, primary colon tumors and non-neoplastic tissues, (2) mass spectrometry screening of 30 paired biopsies, 15 from initially unresectable liver metastases and 15 from adjacent non-neoplastic tissues, (3) investigation of potential modulators of oncogenic signaling associated with therapy resistance, and (4) exploration of the results in an independent pool of approximately 138,000 cells obtained by single-cell RNA-seq in search of associations between targets, signaling pathways and immune populations. After mass spectrometry analysis and integration of metaanalysis data, of the 46 differentially regulated proteins between initially unresectable liver metastases and non-neoplastic tissues, TGFB1, CDH2, APOA1, TNFR2, EGFR, MDH2, ITIH2, YWHAZ, PCBP1, TOP2A and ENO1 (all with upregulation in metastases) and CXCL14, PLA2G2A and CAV1 (with downregulation in metastases) continued in the analysis. Of these, PLA2G2A and CAV1 were not statistically confirmed after comparison with five independent studies. We identified activation of important pathways such as JAK-STAT (zscore=3.18), VEGF (z-score=2.67), WNT (z-score=3.22), PI3K (z-score=3.99), MAPK (z- score=2.85), EGFR (z-score=2.49) and NFkB (z-score=4.11). Then we observed by single-cell RNA-seq analysis that the presence of TGFB1, TNFR2 and EGFR was associated with greater polarization of neutrophils and Treg cells in liver metastases, suggesting a participation of these targets in the recruitment of these immune populations or together during development, establishment of these cells in the liver and disease progression. Both TGFB1 (p=0.01) and TNFR2 (p=0.048) were associated with worse overall survival in patients with metastatic disease and had AUC=0.95 separating primary colon cancer from liver metastases. Specifically, regarding the comparison between initially resectable and unresectable metastases, although we identified some targets with more than 10-fold difference (YWHAZ, AHNAK, HNRNPH1, PCBP1 and TGFB1) only TGFB1 continued in all analyses, however, these results suggest the exploration of these candidates in further studies. When looking for targets related to therapy resistance, our strategy selected 32 proteins differentially regulated in resistant metastases, with involvement of CDH2 (p=0.002), CXCL14 (p=0.05), SERPINA1 (p=0.012) and LRGR (p=0.049) with poor overall survival in metastatic patients. In these tumors, a tendency of activation of the TGF-ß and TNF-α pathways was also observed, already described in the literature due to their participation in the development and progression of metastases, in addition to favoring a resistance profile to tumor cells. By means of a deconvolution analysis, we also observed a greater presence of Treg cells in resistant patients. This relationship between Tregs/LGR5 has also been associated with a worse prognosis in other types of cancers and supports the participation of both in a possible mechanism of resistance in these tumors. Based on the results obtained, we believe to offer a set of unpublished data that can modify the prognosis and diagnosis of liver metastases, as well as contribute to patients having new therapeutic options with improved survival

Proteomics: a tool to investigate of composition and function of HDL in hyperlipidemia / Proteômica: uma ferramenta para a investigação da composição e função da HDL em hiperlipidemia

The inverse relationship between HDL-C (high-density lipoprotein cholesterol) and cardiovascular disease is well established. However, it is consensus that the cholesterol content present in HDL does not capture its complexity, and other metrics need to be explored. HDL is a heterogeneous, protein-enriched particle with functions going beyond lipid metabolism. In this way, its protein content seems to be attractive to investigate its behavior in the face of pathologies. Many of the proteins with important function in HDL are in low abundance (<1% of total proteins), which makes their detection challenging. Quantitative proteomics allows detecting proteins with high precision and robustness in complex matrix. However, quantitative proteomics is still poorly explored in the context of HDL. In this sense, in the second chapter of this thesis, the analytical performance of two quantitative methodologies was carefully investigated. These methods achieved adequate linearity and high precision using labeled peptides in a pool HDL, in addition to comparable ability to differentiate proteins from HDL subclasses of healthy subjects. Another bottleneck that waits for a solution in proteomics is the lack of standardization in data processing and analysis after mass spectrometry acquisition. In addition, interest in the cardioprotective properties of omega-3 is growing, but little is known about its effects on the HDL proteome. Thus, in the third chapter of this thesis, we compared five protein quantification strategies using Skyline and MaxDIA software platforms in order to investigate the HDL proteome from mice submitted to a high-fat diet supplemented or not with omega-3. MaxDIA with label-free quantification (MaxLFQ) achieved high precision to show that polyunsaturated fatty acids remodel the HDL proteome to a less inflammatory profile. Therefore, the two studies presented in this thesis begin to open new paths for a deeper and more reliable understanding of HDL, both at the level of protein quantification by mass spectrometry and after data acquisition

A inversa relação entre HDL-C (do inglês, high-density lipoprotein cholesterol) e doenças cardiovasculares é bem estabelecida. No entanto, é consenso que o conteúdo de colesterol presente na HDL não captura sua complexidade, e outras métricas precisam ser exploradas. A HDL é uma partícula heterogênea, enriquecida em proteínas, com funções que vão além do metabolismo de lipídeos. Dessa forma, seu conteúdo proteico parece ser mais atrativo para exprimir seu comportamento frente às patologias. Muitas das proteínas com função importante estão em baixa abundância (<1% do total de proteínas), o que torna a detecção desafiadora. Métodos quantitativos de proteômica permitem detectar proteínas com alta precisão e robustez em matrizes complexas. No entanto, a proteômica quantitativa ainda é pouco explorada no contexto da HDL. Nesse sentido, no segundo capítulo dessa tese, a performance analítica de dois métodos quantitativos foi criteriosamente investigada, os quais alcançaram adequada linearidade e alta precisão usando peptídeos marcados em um pool de HDL, além de comparável habilidade em diferenciar as proteínas das subclasses da HDL de indivíduos saudáveis. Outro gargalo que aguarda por solução em proteômica é a falta de padronização no processamento e análise de dados após a aquisição por espectrometria de massas. Além disso, é crescente o interesse das propriedades cardioprotetivas do ômega-3, porém pouco se conhece sobre seus efeitos no proteoma da HDL. Então, no terceiro capítulo dessa tese, comparamos cinco estratégias de quantificação de proteínas utilizando os softwares Skyline e MaxDIA com o intuito de comparar o proteoma da HDL de camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica suplementados ou não com ômega-3. MaxDIA com quantificação label-free (MaxLFQ) apresentou alta precisão para mostrar que o ômega-3 remodela o proteoma da HDL para um perfil menos inflamatório. Portanto, os dois estudos apresentados nessa tesa começam a abrir novos caminhos para o entendimento mais profundo e confiável da HDL tanto por meio da quantificação das proteínas por espectrometria de massas quanto após à aquisição dos dados

Proteomic analysis of human keratinocytes under UVA-induced stress / Análise proteômica de queratinócitos humanos sob estresse induzido por luz UVA

The solar ultraviolet (UV) radiation that reaches the Earth is composed of 95% of UVA (320 to 400 nm) and 5% of UVB (280 to 320 nm) radiation. UVB is carcinogenic, generating potentially mutagenic DNA lesions. The solar UVA radiation also causes DNA damage, but this fact does not fully account for its biological impact. UVA is absorbed by non-DNA cellular chromophores, generating reactive oxygen species such as singlet oxygen. Knowing the proteome mediates stress responses in cells, here we investigated the cellular effects of a non-cytotoxic dose of UVA radiation, equivalent to about 20 minutes of midday sun exposure, on the proteome of human keratinocytes. Using a combination of mass spectrometry-based proteomics, bioinformatics, and conventional biochemical assays, we analyzed two aspects of UVA-induced stress: spatial remodeling of the proteome in subcellular compartments 30 minutes after stress and long-term changes in protein levels and secretion (24 hours and 7 days postirradiation). In the first part of this thesis, we quantified and assigned subcellular localization for over 3000 proteins, of which about 600 potentially redistribute upon UVA exposure. Protein redistributions were accompanied by redox modulations, mitochondrial fragmentation and DNA damage. In the second part of the work, our results showed that primary human keratinocytes enter senescence upon exposure to a single dose of UVA, mounting antioxidant and inflammatory responses. Cells under UVA-induced senescence further elicit paracrine responses in neighboring premalignant HaCaT epithelial cells via inflammatory mediators. Altogether, these results reiterate the role of UVA radiation as a potent metabolic stressor in the skin

A radiação ultravioleta (UV) solar que atinge a superfície terrestre é composta por 95% de radiação UVA (320 a 400 nm) e 5% de radiação UVB (280 a 320 nm). A radiação UVB é carcinogênica e gera lesões potencialmente mutagênicas no DNA. A radiação UVA solar também gera danos no DNA, mas a genotoxicidade dessa radiação não explica inteiramente o seu impacto biológico. Atualmente, sabe-se que a radiação UVA é absorvida por cromóforos celulares, gerando espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete. Sabendo que o proteoma é um mediador de respostas ao estresse celular, nós investigamos os efeitos celulares de uma dose não-citotóxica de radiação UVA, equivalente a cerca de 20 minutos de exposição ao sol, no proteoma de queratinócitos humanos. Utilizando espectrometria de massas, bioinformática e ensaios bioquímicos convencionais, nós analisamos dois aspectos do estresse induzido por radiação UVA: o remodelamento espacial do proteoma 30 minutos depois do estresse e alterações nos níveis e na secreção de proteínas no longo prazo (24 horas e 7 dias depois da irradiação). Na primeira parte desta tese, nós quantificamos e atribuímos classificações de localização subcelular a mais de 3000 proteínas. Dentre essas proteínas, 600 tem potencialmente a sua distribuição subcelular alterada em resposta à radiação. As redistribuições subcelulares são acompanhadas de modulações redox, fragmentação mitocondrial e danos no DNA. Na segunda parte da tese, os nossos resultados mostraram que queratinócitos humanos primários entram em senescência sob exposição a uma única dose de radiação UVA, montando respostas antioxidantes e pró-inflamatórias. Células sob senescência induzida por UVA, por sua vez, desencadeiam respostas parácrinas em queratinócitos pré-tumorais (células HaCaT) por meio de mediadores inflamatórios. Em conjunto, esses resultados reiteram o papel da radiação UVA como um potente estressor metabólico em células da pele

Análise proteômica de células BEAS-2B expostas a benzo[α]pireno e nicotinamida ribosídeo / Proteomic Analysis of BEAS-2B cells exposed to benzo[α]pyrene and nicotinamide riboside

Responsável por milhões de óbitos anuais e um grande custo para a saúde pública, o câncer é a segunda maior causa de mortes no mundo. Dentre seus diversos tipos, o câncer de pulmão, além da alta incidência, é um dos mais letais. A exposição a substâncias tóxicas provenientes da combustão de matéria orgânica, assim como o consumo de cigarro, são os principais responsáveis pela alta incidência de câncer de pulmão. Dentre estas substâncias, está o benzo[α]pireno (B[α]P), um carcinógeno completo, ou seja, capaz de iniciar e promover o processo de carcinogênese. Resultados anteriores obtidos pelo grupo demonstraram que células BEAS-2B expostas a 1 µM de B[α]P apresentaram alterações das concentrações de metabólitos intracelulares, indução de estresse redox e hipermetilação do DNA. A exposição a 1 µM de nicotinamida ribosídeo (NR), um dos precursores de NAD+, foi capaz de proteger as células BEAS-2B contra a transformação induzida por B[α]P, além de impedir totalmente que células não expostas a B[α]P formassem colônias em soft-agar. A utilização da proteômica neste trabalho permitiu verificar a abundância das proteínas nos quatro diferentes grupos de exposição: Controle, B[α]P, B[α]P + NR e NR. Após 120 h de exposição as células foram coletadas, as proteínas extraídas e preparadas para análise. Foram descobertas 3024 proteínas posteriormente analisadas com o objetivo de elucidar vias possivelmente envolvidas na proteção contra o processo de transfomação maligna. Os grupos NR e Controle demonstram ser mais parecidos em relação ao seu conteúdo, enquanto os grupos B[α]P e B[α]P + NR foram mais semelhantes entre si. A análise de proteínas exclusivas revelou menos processos relacionados ao reparo de DNA no grupo tratado apenas com B[α]P quando comparado com B[α]P + NR. A análise estatística do total de proteínas utilizando o teste ANOVA (p < 0,05, N = 5) revelou 564 proteínas diferencialmente expressas entre os grupos. A clusterização nos permitiu observar a diferença na abundância de proteínas entre os quatro tratamentos. As proteínas estão envolvidas em funções como a regulação do metabolismo, resposta a estresse, transdução de sinal, regulação de expressão gênica e morte celular. Um dos clusters (cluster 1), contendo 59 proteínas, revelou poucos processos na análise de enriquecimento, mas as proteínas contidas nele apresentam funções como controle da divisão celular, apoptose e proteção ao estresse redox. Nele podemos observar que, no geral, o tratamento com B[α]P aumentou a abundância de algumas proteínas, o que foi revertido no grupo B[α]P + NR. O tratamento apenas com NR diminuiu a abundância das proteínas contidas nesse cluster. Outro cluster (cluster 4) apresentou 51 proteínas de abundância diminuída durante a exposição ao B[α]P, o que se reverteu no grupo B[α]P + NR. As proteínas desse cluster estão envolvidas em etapas importantes da via glicolítica, de crescimento, adesão, migração e invasão celular. Apesar de ser descrito que a exposição a NR pode aumentar a eficiência do reparo de DNA, os resultados apresentados nesse trabalho indicam que o efeito protetor pode estar relacionado com a modulação do ciclo celular ou alterações na adesão celular

Responsible for millions of annual deaths and a great health expense, cancer is the second leading cause of death in the world. Among its many types, lung cancer, besides its high incidence, is also one of the most lethal. Exposure to toxic substances resulting from the combustion of organic matter, as well as cigarette consumption, are the mainly responsible for the high incidence of lung cancer. One of these substances is benzo[α]pyrene (B[α]P), a complete carcinogen, able to initiate and promote the carcinogenesis process. Results obtained previously demonstrated that BEAS-2B cells exposed to 1 µM BaP presented alterations in the levels of intracellular metabolites, induction of oxidative stress, and hypermethylation of DNA. The exposure to 1 µM nicotinamide riboside (NR), one of the precursors of NAD+, was able to protect BEAS-2B cells against the transformation induced by B[α]P, moreover, it also totally prevented the colonies formation on soft agar in cells not exposed to B[α]P. The use of proteomics allowed us to verify the abundance of proteins in the four different exposure groups: Control, B[α]P, B[α]P + NR e NR. After 120h of exposure, the cells were collected followed by the extraction of the proteins. A total of 3024 proteins were identified and analyzed aiming to elucidate possible pathways involved in the protective effect against the malignant transformation induced by B[α]P. The NR and Control groups showed to be more similar, while B[α]P and B[α]P + NR were more similar. The analysis of exclusive proteins revealed fewer processes related to DNA repair in B[α]P when compared with B[α]P + NR. The statistical analysis of the total proteins using the ANOVA test (p <0.5, N = 5) revealed 564 proteins differentially expressed between the groups. The heatmap showed the difference in protein abundance between the four treatments. Proteins are involved in functionssuch asthe regulation of metabolism, stress response, signal transduction, regulation of gene expression, and cell death. One of the clusters (cluster 1), containing 59 proteins, revealed a few processes in the enrichment analysis, but the proteins contained in it have functions such as control of cell division, apoptosis, and protection from redox stress. It is possible to observe, in general, treatment with B[α]P increased the abundance of some proteins, which was partially reversed in group B[α]P + NR. On the other hand, the NR treatment decreased the abundance of proteins contained in this cluster. Another cluster (cluster 4) showed 51 proteins of decreased abundance during exposure to B [α] P, which was partially reversed in group B[α]P + NR. The proteins in this cluster are involved in important stages of the glycolytic pathway, also in growth, adhesion, migration, and cell invasion. Although it has been described that exposure to NR can increase the efficiency of DNA repair, the results presented in this work indicate that the protective effect may be related to the modulation of the cell cycle or cell adehsion modifications

Medicina de precisión para el diagnóstico de sepsis neonatal: revisión sistemática y metaanálisis / Precision medicine for the diagnosis of neonatal sepsis: systematic review and meta-analysis

ANTECEDENTES: Los biomarcadores actuales para el diagnóstico de sepsis neonatal tienen una exactitud limitada. El desarrollo de la medicina de precisión basada en tecnologías ómicas ofrece una oportunidad para mejorar el diagnóstico de la sepsis neonatal. OBJETIVOS: Evaluar la sensibilidad y especificidad de las pruebas basadas en tecnologías ómicas (metabolómica, proteómica y genómica/transcriptómica) para el diagnóstico de sepsis neonatal. METODOLOGÍA: Se realizó una revisión sistemática en bases de datos electrónicas. Se incluyeron estudios observacionales y ensayos clínicos que evaluaran las pruebas basadas en tecnologías ómicas en neonatos comparado con el cultivo para el diagnóstico de sepsis neonatal. Dos revisores independientes realizaron la evaluación de la calidad de los estudios y la extracción de los datos. Para el metaanálisis se realizó un modelo de efectos aleatorios y se planeó una evaluación de la heterogeneidad a través de un análisis de subgrupos por prueba ómica, edad gestacional y tiempo de establecimiento de la sepsis. RESULTADOS: Se observa expresión diferencial del genoma, proteoma y metaboloma entre los neonatos con y sin sepsis, identificando diferentes biomarcadores. El metaanálisis mostró una medida de resumen combinada para la sensibilidad de 0,88 (IC 95% 0,72-0,96), especificidad de 0,76 (IC 95% 0,62-0,85). CONCLUSIÓN: Las pruebas basadas en ómicas tienen una alta sensibilidad, siendo las de mejor rendimiento las basadas en genómica/transcriptómica. Los estudios tienen alta heterogeneidad.

BACKGROUND: Current biomarkers for the diagnosis of neonatal sepsis llave limited accuracy. The development of precision medicine based on omic's technologies offer an opportunity to improve the diagnosis of neonatal sepsis. AIM: To evalúate the sensitivity and specificity of tests based on omic technologies (metabolomics, proteomics and genomics) for the diagnosis of neonatal sepsis. METHODS: A systematic review was carried out in electronic databases. Observational studies and clinical trials evaluating tests based on omic technologies in neonates compared to culture for the diagnosis of neonatal sepsis were included. For the meta-analysis, a random effects model and an evaluation of heterogeneity were proposed through a subgroup analysis by omic test, gestational age and time of establishment of sepsis. RESULTS: Differential expression of the genome, proteome and metabolome is observed between neonates with and without sepsis, identifying different biomarkers. The meta-analysis showed a pooled summary measure for sensitivity of0.88 (95% CI 0.72, 0.96), specificity of0.76 (95% CI 0.62, 0.85). CONCLUSION: Omics-based tests have a high sensitivity, with the best performing ones being those based on genomics / transcriptomics. The studies have high heterogeneity.

Cambios en el perfil protéico de E. coli O157:H7 frente al tratamiento con Ib-M1 e IONP@Ib-M1 / Changes in the protein profile of E. coli O157: H7 against treatment with Ib-M1 and IONP@Ib-M1 / Identificação de alterações no perfil protetor de E. coli O157: H7 contra o tratamento com Ib-M1 e IONP@Ib-M1

Resumen Escherichia coli 0157:H7 es una bacteria patógena reconocida por su capacidad de resistencia a diversos antibióticos; razón por la cual, se generan complicaciones en el tratamiento de infecciones producidas por esta bacteria. El péptido Ib-M1 y el bioconjugado I0NP@Ib-M1 han surgido como una nueva alternativa antimicrobiana contra E. coli 0157:H7. El mecanismo de acción de Ib-Mi e I0NP@Ib-M1 contra esta bacteria aún es desconocido; por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue identificar el cambio en el perfil de proteínas de E. coli 0157:H7 luego del tratamiento con Ib-M1 e I0NP@ Ib-M1 como primer paso para determinar su mecanismo de acción. Para esto, se llevó a cabo la obtención de proteínas, posteriormente se realizó una electroforesis bidimensional para finalmente realizar la determinación de la variabilidad de los perfiles proteicos. Una vez obtenidos estos perfiles, se llevó a cabo un análisis de varianza (AN0VA). Se identificaron 72 proteínas expresadas diferencialmente, las cuales pueden relacionarse con el efecto sobre el crecimiento de la bacteria en presencia de Ib-M1 e I0NP@Ib-M. Estas proteínas se encuentran involucradas en procesos de transferencia de grupos acilo (proteína Yhbs), translocación de lipoproteínas (proteína LolA) y transporte de aminoácidos (proteína GpmA), entre otros.

Abstract Escherichia coli 0157: H7 is a pathogenic bacterium which is recognized for the ability to resist multiple antibiotics; accordingly, complications occur in the treatment of infections caused by this bacterium. The Ib-M1 peptide and the I0NP @ Ib-M1 bioconjugate have emerged as a new antimicrobial alternatives against E. coli 0157: H7. The mechanism of action of Ib-M1 and I0NP @ Ib-M1 against this bacterium is still unknown; therefore, the goal of this research was to identify the change in the proteins profile of E. coli 0157: H7 after treatment with Ib-M1 and I0NP @ Ib-M1 as a first step to determine its mechanism of action. For this, the proteins were obtained first, and then a two-dimensional electrophoresis was performed to finally determine the variability of the protein profiles. 0nce the protein profiles were obtained, an analysis of variance (AN0VA) was carried out. 72 differentially expressed proteins were identified, which can be connected to the effect on the bacterium's growth in the presence of Ib-M1 and I0NP @ Ib-M. These proteins are involved in acyl groups transfer processes (Yhbs protein), lipoprotein translocation (LolA protein) and amino acid transport (GpmA protein), among others.

Resumo Escherichia coli O157: H7 é uma bactéria patogênica reconhecida por sua capacidade de resistir a vários antibióticos; razão pela qual, complicações são geradas no tratamento de infecções produzidas por essa bactéria. O peptídeo Ib-M1 livre e imobilizado em nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (IONP @ Ib-M1) surgiu como uma nova alternativa antimicrobiana contra E. coli O157: H7 e isolados clínicos desta bactéria. O mecanismo de ação de Ib-M1 e IONP @ Ib-M1 contra E. coli O157: H7 ainda é desconhecido; Portanto, o objetivo desta pesquisa foi identificar a alteração no perfil proteico de E. coli O157: H7 após o tratamento com Ib-M1 e IONP @ Ib-M1 como um primeiro passo para determinar seu mecanismo de ação. Para isso, foi realizada a obtenção das proteínas, posteriormente foi realizada uma eletroforese bidimensional para finalmente determinar a variabilidade dos perfis protéicos. Uma vez obtidos os perfis de proteínas, foi realizada uma análise de variância (ANOVA). Os resultados mostram a identificação de proteínas expressas diferencialmente e que estão envolvidas em processos de transferência de grupos acila (proteína Yhbs), translocação de lipoproteínas (proteína LolA) e transporte de aminoácidos (proteína GpmA), entre outros.

Proteomics characterization of Staphylococcus spp. from goat mastitis and phenogeno-typical assessment of resistance to beta-lactamics

ABSTRACT: Mastitis occupies a prominent place among the diseases that affect dairy herds due to economic problems and public health. Staphylococcus spp. are infectious agents more involved in the etiology of caprine mastites, especially coagulase-negative Staphylococcus. Nineteen isolates of Staphylococcus spp. were obtained from subclinical caprine mastitis. All isolates were characterized by MALDI-TOF MS, being 47.36% (9/19) identified for S. epidermidis, 15.78% (3/19) for S. warneri, 10.52% (2/19) for S. aureus and S. caprae and 5.26% (1/19) for S. lugdunensis, S. simulans, and S. cohnii. All isolates characterized by MALDI-TOF were subjected a to polymerase chain reaction (PCR) for the 16S rRNA gene of Staphylococcus spp. to confirm the gender. After determining the species, tests for phenotypic detection of resistance to beta-lactams were carried out simple disk diffusion oxacillin, cefoxitin, penicillin G and amoxicillin + clavulanic acid, agar screen oxacillin and microdilution (MIC) cefoxitin. The disk diffusion test showed a strength of 58% (11/19) for penicillin G, 26.31% (5/19) for cefoxitin and 26.31% (5/19) for oxacillin. All strains were susceptible to amoxicillin + clavulanic acid and agar screen oxacillin. In the MIC, 63.15% (12/19) of the samples were cefoxitin resistant (MIC >4.0g/ml). Then isolates were subjected to detection of the mecA resistance genes and regulators (mecl and mecRI), mecC and blaZ. Two samples of Staphylococcus epidermidis had the mecA gene. All isolates were negative for the mecA gene variant, mecl, mecRI, mecC and blaZ. These findings reinforce the importance of this group of microorganisms in the etiology of subclinical mastitis in goats and open perspectives for future research to investigate the epidemiology of the disease.

RESUMO: A mastite ocupa lugar de destaque entre as doenças que acometem o rebanho leiteiro, em virtude de problemas econômicos e de saúde pública. Staphylococcus spp. são os agentes infecciosos mais envolvidos na etiologia das mastites caprinas, principalmente Staphylococcus coagulase negativo. Dezenove isolados de Staphylococcus spp. foram obtidos a partir de mastite caprina subclínica. Todos os isolados foram caracterizados por MALDI-TOF MS, sendo 47,36% (9/19) identificadas como S. epidermidis, 15,78%(3/19) como S. warneri, 10,52% (2/19) como S. caprae e S. aureus e 5,26% (1/19) tanto para S. lugdunensis, como para S. simulans e S. cohnii. Todos os isolados caracterizados pelo MALDI-TOF foram submetidos a reação em cadeia da polimerase (PCR) para o gene 16rRNA de Staphylococcus spp. para a confirmação do gênero. Após a determinação da espécie, foram realizadas as provas para a detecção fenotípica de resistência aos beta-lactâmicos: difusão em disco simples de oxacilina, cefoxitina, penicilina G e amoxacilina +ácido clavulânico, ágar screen de oxacilina e microdiluição em caldo (MIC) de cefoxitina. O teste de difusão em disco demonstrou resistência de 58% (11/19) para penicilina G, 26,31% (5/19) para cefoxitina e 26,31% (5/19) para oxacilina. Todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico e ao ágar screen de oxacilina. Pelo MIC, 63,15% (12/19) das amostras foram resistentes a cefoxitina (MIC >4,0g/ml). Em seguida os isolados foram submetidos a detecção dos genes de resistência mecA e seus reguladores (mecl e mecRI), mecC e blaZ. Duas amostras de S. epidermidis apresentaram o gene mecA. Todos os isolados foram negativos para a variante do gene mecA, mecl, mecRI, mecC e blaZ. Tais achados reforçam a importância deste grupo de microrganismos na etiologia da mastite subclínica em caprinos e abre perspectivas para futuras pesquisas para a investigação da epidemiologia da doença.

Proteomics characterization of Staphylococcus spp. from goat mastitis and phenogeno-typical assessment of resistance to beta-lactamics / Caracterização proteômica de Staphylococcus spp. oriundos de mastite caprina e avaliação fenogenotípica da resistência aos beta-lactâmicos

Mastitis occupies a prominent place among the diseases that affect dairy herds due to economic problems and public health. Staphylococcus spp. are infectious agents more involved in the etiology of caprine mastites, especially coagulase-negative Staphylococcus. Nineteen isolates of Staphylococcus spp. were obtained from subclinical caprine mastitis. All isolates were characterized by MALDI-TOF MS, being 47.36% (9/19) identified for S. epidermidis, 15.78% (3/19) for S. warneri, 10.52% (2/19) for S. aureus and S. caprae and 5.26% (1/19) for S. lugdunensis, S. simulans, and S. cohnii. All isolates characterized by MALDI-TOF were subjected a to polymerase chain reaction (PCR) for the 16S rRNA gene of Staphylococcus spp. to confirm the gender. After determining the species, tests for phenotypic detection of resistance to beta-lactams were carried out simple disk diffusion oxacillin, cefoxitin, penicillin G and amoxicillin + clavulanic acid, agar "screen" oxacillin and microdilution (MIC) cefoxitin. The disk diffusion test showed a strength of 58% (11/19) for penicillin G, 26.31% (5/19) for cefoxitin and 26.31% (5/19) for oxacillin. All strains were susceptible to amoxicillin + clavulanic acid and agar "screen" oxacillin. In the MIC, 63.15% (12/19) of the samples were cefoxitin resistant (MIC >4.0μg/ml). Then isolates were subjected to detection of the mecA resistance genes and regulators (mecl and mecRI), mecC and blaZ. Two samples of Staphylococcus epidermidis had the mecA gene. All isolates were negative for the mecA gene variant, mecl, mecRI, mecC and blaZ. These findings reinforce the importance of this group of microorganisms in the etiology of subclinical mastitis in goats and open perspectives for future research to investigate the epidemiology of the disease.(AU)

A mastite ocupa lugar de destaque entre as doenças que acometem o rebanho leiteiro, em virtude de problemas econômicos e de saúde pública. Staphylococcus spp. são os agentes infecciosos mais envolvidos na etiologia das mastites caprinas, principalmente Staphylococcus coagulase negativo. Dezenove isolados de Staphylococcus spp. foram obtidos a partir de mastite caprina subclínica. Todos os isolados foram caracterizados por MALDI-TOF MS, sendo 47,36% (9/19) identificadas como S. epidermidis, 15,78%(3/19) como S. warneri, 10,52% (2/19) como S. caprae e S. aureus e 5,26% (1/19) tanto para S. lugdunensis, como para S. simulans e S. cohnii. Todos os isolados caracterizados pelo MALDI-TOF foram submetidos a reação em cadeia da polimerase (PCR) para o gene 16rRNA de Staphylococcus spp. para a confirmação do gênero. Após a determinação da espécie, foram realizadas as provas para a detecção fenotípica de resistência aos beta-lactâmicos: difusão em disco simples de oxacilina, cefoxitina, penicilina G e amoxacilina +ácido clavulânico, ágar "screen" de oxacilina e microdiluição em caldo (MIC) de cefoxitina. O teste de difusão em disco demonstrou resistência de 58% (11/19) para penicilina G, 26,31% (5/19) para cefoxitina e 26,31% (5/19) para oxacilina. Todas as amostras foram sensíveis a amoxicilina + ácido clavulânico e ao ágar "screen" de oxacilina. Pelo MIC, 63,15% (12/19) das amostras foram resistentes a cefoxitina (MIC >4,0μg/ml). Em seguida os isolados foram submetidos a detecção dos genes de resistência mecA e seus reguladores (mecl e mecRI), mecC e blaZ. Duas amostras de S. epidermidis apresentaram o gene mecA. Todos os isolados foram negativos para a variante do gene mecA, mecl, mecRI, mecC e blaZ. Tais achados reforçam a importância deste grupo de microrganismos na etiologia da mastite subclínica em caprinos e abre perspectivas para futuras pesquisas para a investigação da epidemiologia da doença.(AU)

Utility of biomarkers in traumatic brain injury: a narrative review / Utilidad de los biomarcadores en trauma craneoencefálico: una revisiOn narrativa

Abstract Introduction: With the evolution of diagnostic techniques in traumatic brain injury (TBI), the study of neurological injury has made progress based on the concepts of primary and secondary injury, leading to the era of proteomics to understand the complex molecular events involved in the process. Objectives: This narrative review is intended to discuss the state of the art of the most frequently used biomarkers in TBI, their clinical utility, and the implications for therapeutic decision-making protocols. Materials and methods: In order to fulfill the objective of this paper, a literature review was conducted of the most important databases. Results: Several biomarkers have been studied as prognostic factors in patients with TBI. Learning about their sensitivity and specificity in neurological injury, and its post-trauma evolution over time, has been the goal of various papers in the past few years. Conclusion: Breakthroughs in the study of protein degradation make it necessary to broaden the spectrum and knowledge of new diagnostic methods in TBI. Further studies are needed to define the role of biomarkers and to promote protocols integrating specific values.

Resumen Introducción: Con la evolución de las técnicas diagnósticas en el trauma craneoencefálico, el estudio de la lesión neurológica ha progresado sobre los conceptos de lesión primaria y secundaria, para entrar así en la era de la proteómica y, con ella, entender los complejos eventos moleculares existentes en su proceso. Objetivos: En esta revisión narrativa se pretende presentar el estado actual de los biomarcadores que más se usan en lesión cerebral traumática, su utilidad clínica y las implicaciones en protocolos de decisión terapéutica. Materiales y métodos: Para dar respuesta al objetivo de este trabajo, se realizó una revisión de la literatura en las principales bases de datos. Resultados: Se han estudiado varios biomarcadores como factor pronóstico en pacientes con trauma craneoencefálico. Conocer su sensibilidad y especificidad para la lesión neurológica, así como su evolución en el tiempo tras el traumatismo, ha sido el objetivo de diversos trabajos en los últimos años. Conclusión: El avance en el estudio de los productos de degradación de las proteínas hace necesario ampliar el espectro y el conocimiento en el campo de los nuevos métodos diagnósticos en el trauma craneoencefálico. Se requieren más estudios para definir la función de los biomarcadores y proponer protocolos que integren valores específicos.

Perfil proteômico de bactérias presentes em canais radiculares de dentes com periodontite apical sintomática ou assintomática / Proteomic profile of bacteria present in root canals of teeth with symptomatic or asymptomatic apical periodontitis

As infecções endodônticas são causadas por uma comunidade multiespécie de bactérias. Com os métodos de identificação microbiológica e quantificação de endotoxinas, é difícil inferir a fisiologia, a função e a patogenicidade microbiana. Assim, a análise proteômica é uma técnica que pode revolucionar o estudo da patogênese das infecções endodônticas. O presente estudo tem por objetivo analisar o perfil proteômico de infecções endodônticas relacionadas a dentes com periodontite apical sintomática ou assintomática utilizando cromatografia líquida associada à espectrometria de Massas. A análise deste perfil proteômico visa a proporcionar a compreensão dos aspectos ecológicos e patogênicos do comportamento de comunidades bacterianas endodônticas através da identificação de proteínas expressas no referido ambiente no momento da coleta e a determinação da função dessas proteínas. Foram coletadas amostras de 18 pacientes encaminhados para tratamento de canal radicular ou tratamento de emergência na Faculdade de Odontologia de Araçatuba FOA ­ UNESP. Foram incluídos dentes com infecção endodôntica primária, sintomáticos ou assintomáticos. A identificação dos peptídeos foi feita num sistema nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS system (Waters), a identificação das proteínas foi obtida utilizando o software Protein Lynx Global Server (PLGS) versão 3.0, utilizando o banco de dados de proteínas UniProtKB. A diferença de expressão entre os grupos foi obtida através do mesmo software, considerando-se p<0,05 para as proteínas subreguladas e 1-p>0,95 para as proteínas suprareguladas. Foram identificados um total de 2181 números de acessos entre fragmentos, isoformas e proteínas completas humana e 51 proteínas bacterianas e ambas foram classificadas quanto a sua função biológica, em relação às proteínas exclusivas de cada grupo, 347 proteínas foram identificadas no grupo sintomático. As funções biológicas mais prevalentes foram comunicação celular e transdução de sinais, seguidas pela resposta imune, observou-se diversas proteínas exclusivamente expressas no grupo sintomático, indicando a influência direta da periodontite sintomática na resposta do hospedeiro(AU)

Endodontic infections are caused by a multispecies community of bacteria. With microbiological identification methods and endotoxin quantification, it is difficult to infer physiology, function and microbial pathogenicity. Thus, proteomic analysis is a technique that can revolutionize the study of the pathogenesis of endodontic infections. The present study aims to analyze the proteomic profile of endodontic infections related to teeth with symptomatic or asymptomatic apical periodontitis using liquid chromatography associated with mass spectrometry. The analysis of this proteomic profile aims to provide an understanding of the ecological and pathogenic aspects of the behavior of endodontic bacterial communities by identifying proteins expressed in the said environment at the time of collection and determining the function of these proteins. Samples were collected from 18 patients referred for root canal treatment or emergency treatment at the School of Dentistry of Araçatuba FOA - UNESP. Teeth with primary endodontic infection, symptomatic or asymptomatic were included. The identification of peptides was made in a nanoACQUITY UPLC-Xevo QTof MS system (Waters) system, the identification of proteins was obtained using protein lynx global server (PLGS) software version 3.0, using the UniProtKB protein database. The difference in expression between the groups was obtained through the same software, considering p<0.05 for subregulated proteins and 1-p>0.95 for the superregulated proteins. A total of 2,181 access numbers were identified between human fragments, isoforms and complete proteins and 51 bacterial proteins, and both were classified as their biological function, in relation to the exclusive proteins of each group, 347 proteins were identified in the symptomatic group. The most prevalent biological functions were cellular communication and signal transduction, followed by the immune response, and several proteins were observed exclusively expressed in the symptomatic group, indicating the direct influence of symptomatic periodontitis on the host response(AU)

Análise proteômica quantitativa em ameloblastomas / Quantitative proteomic analysis in ameloblastomas

O ameloblastoma é um tumor odontogênico epitelial benigno caracterizado por crescimento lento localmente agressivo, alta morbidade e grande potencial de recidiva. Apesar dos avanços em bioinformática que levaram ao desenvolvimento de tecnologias que permitiram o estudo das ciências "ômicas", há escassos estudos de proteômica em ameloblastomas. O nosso objetivo, portanto, foi realizar uma análise quantitativa do perfil proteômico de ameloblastomas em comparação a folículos pericoronários. No presente estudo, nós utilizamos a estratégia de proteômica shotgun para identificação de proteínas usando a combinação de cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem (liquid chromatography-tandem mass spectrometry; LC-MS/MS). Também foram realizadas análises de cluster e de enriquecimento funcional das proteínas que apresentaram abundâncias alteradas nos ameloblastomas. Nesse estudo realizou-se ainda avaliação do status de mutação em BRAF nos casos de ameloblastoma. Por fim, a validação dos resultados da etapa de proteômica foi feita por meio de imunoistoquímica. A análise proteômica quantitativa comparativa resultou na identificação de 1.353 proteínas. Os ameloblastomas mostraram um perfil proteômico distinto daquele encontrado nos folículos dentais, com 33 proteínas super-reguladas e 21 para sub-reguladas. As proteínas super-reguladas estão envolvidas no metabolismo da glicose e nas vias de biossíntese de macromoléculas, indicando um mecanismo adaptativo de crescimento do tumor, enquanto a maioria das proteínas sub-reguladas desempenha papéis importantes na produção de energia celular mitocondrial e na regulação do metabolismo de oxidorredutase, sugerindo disfunção mitocondrial e resposta ao estresse oxidativo. BRAF p.V600E foi detectado na maioria dos ameloblastomas e pode estar relacionado à indução de fluxo glicolítico, assim como ao estresse oxidativo. Para investigar a ativação do sistema antioxidante, nós avaliamos a imunoexpressão da enzima antioxidante denominada glutationa S-transferase ômega 1 (GSTO1), que foi super-regulada nos ameloblastomas. Os ameloblastomas mostraram imunoexpressão de GSTO1 difusa e com intensidade moderada a forte, enquanto uma imunoexpressão fraca ou negativa de GSTO1 foi observada nos folículos pericoronários. Nossa hipótese é que o ameloblastoma apresenta reprogramação metabólica glicolítica com alta geração de precursores biossintéticos. Além disso, foi observada uma baixa abundância de componentes respiratórios mitocondriais, o que está possivelmente associado à disfunção mitocondrial. Nós identificamos pela primeira vez alterações em vias metabólicas críticas que não só contribuem para a elucidação da patogênese do ameloblastoma, mas também podem ser alvos terapêuticos potenciais para esses tumores

Ameloblastoma is a benign epithelial odontogenic tumor characterized by slow but locally aggressive growth, high morbidity and great potential for recurrence. Despite the advances in bioinformatics that led to the development of technologies that allowed the study of omics sciences, there are scarce studies of proteomics in ameloblastomas. Our aim was to perform a quantitative analysis of the proteomic profile of ameloblastomas compared to dental follicles. In the present study, we performed shotgun proteomics to identify proteins using the combination of liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We also performed cluster and functional enrichment analyses of proteins with altered abundances in ameloblastomas. This study also carried out an assessment of the BRAF mutation status in cases of ameloblastoma. Finally, the validation of the results of the proteomics step was performed using immunohistochemistry. Quantitative comparative proteomic analysis resulted in the identification of 1,343 proteins. Ameloblastomas were shown to harbor a proteomic profile distinct from that found in dental follicles, with 33 over-regulated and 21 down-regulated proteins. Overregulated proteins are involved in glucose metabolism and biosynthesis pathways, indicating an adaptative tumor growth mechanism. Most of the down-regulated proteins play prominent roles in cellular mitochondrial energy production and oxidoreductase metabolism regulation, suggesting mitochondrial dysfunction and oxidative stress response. BRAF p.V600E was detected in most ameloblastomas and it may be related to the induction of glycolytic flux, as well as oxidative stress. To investigate the activation of the antioxidant system, we assessed the immunoexpression of the antioxidant enzyme glutathione S-transferase omega 1 (GSTO1), which was up-regulated in ameloblastomas. Ameloblastomas showed diffuse and moderate to strong GSTO1 immunoexpression, whereas weak or negative imunoexpression was observed in dental follicles. We hypothesize that ameloblastoma presents metabolic reprogramming towards a more glycolytic state with high biosynthetic precursor generation. In addition, a low abundance of mitochondrial respiratory components possibly associated with mitochondrial dysfunction was observed. We were able to identify for the first-time alterations in critical metabolic pathways, which not only contribute to the elucidation of ameloblastoma pathogenesis but also could be potential targets for drug therapy in these tumors.

Plataformas de secuenciación de nueva generación y proteómica aplicadas a la virología vegetal: ¿Cómo ha avanzado Colombia? / Next generation sequencing and proteomics in plant virology: how is colombia doing?

ABSTRACT Crop production and trade are two of the most economically important activities in Colombia, and viral diseases cause a high negative impact to agricultural sector. Therefore, the detection, diagnosis, control, and management of viral diseases are crucial. Currently, Next-Generation Sequencing (NGS) and 'Omic' technologies constitute a right-hand tool for the discovery of novel viruses and for studying virus-plant interactions. This knowledge allows the development of new viral diagnostic methods and the discovery of key components of infectious processes, which could be used to generate plants resistant to viral infections. Globally, crop sciences are advancing in this direction. In this review, advancements in 'omic' technologies and their different applications in plant virology in Colombia are discussed. In addition, bioinformatics pipelines and resources for omics data analyses are presented. Due to their decreasing prices, NGS technologies are becoming an affordable and promising means to explore many phytopathologies affecting a wide variety of Colombian crops so as to improve their trade potential.

RESUMEN La producción y el comercio de cultivos es una de las actividades económicas más importantes para el país. Las enfermedades causadas por virus ocasionan graves pérdidas económicas en el sector, por lo tanto, la detección, diagnóstico y diseño de estrategias para su control y manejo es crucial. Las tecnologías de secuenciación masiva (NGS por sus siglas en ingles) y las ciencias Ómicas constituyen hoy, una herramienta para el descubrimiento de nuevos virus y para el estudio de la interacción entre los virus y su hospedero vegetal. Este conocimiento no solo permite el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico, sino también permite el descubrimiento de componentes claves en la infección, los cuales podrían usarse para obtener plantas resistentes a los virus. En el mundo, el manejo de cultivos se está trabajando con ese enfoque. Por lo tanto, en esta revisión se presentan las diferentes aplicaciones de las tecnologías ómicas en la virología de plantas y el avance que ha alcanzado Colombia. Adicionalmente, se muestran los diferentes recursos y programas usados para el análisis bioinformático de datos ómicos. Debido a su costo cada vez más reducido, las tecnologías NGS son una excelente oportunidad para explorar fitopatologías en una gran diversidad de productos agrícolas y para mejorar su potencial comercial.

Medicina de precisión y medicina basada en la evidencia / Precision medicine and evidence-based medicine

El médico en la práctica clínica, asiste con frustración a la ausencia de una metodología uniforme y estandarizada, para procesar la gran avalancha de datos clínicos. Se ve envuelto en un proceso de toma de decisiones en condiciones de incertidumbre. No existen enfermedades sino enfermos. El inconsciente del pensamiento médico, parece querer expresar así la variabilidad extrema individual, que observa en la práctica clínica, así como la incertidumbre que le acompaña frente a la supuesta seguridad de las reglas diagnósticas y terapéuticas. La medicina de precisión y la medicina basada en la evidencia, nacieron con la intención de dar mejores respuestas a espacios de incertidumbre, ante problemas clínicos desde distintos ámbitos de la medicina como la genómica o el big data. Ambas incrementan la capacidad de ofrecer la intervención más adecuada para obtener el mejor resultado en términos de supervivencia, complicaciones y costo-efectividad para cada perfil de paciente en función de sus características biométricas. Los postulados de la medicina de precisión y la medicina basada en la evidencia estarán bajo escrutinio permanente de la comunidad científica en relación a: su racionalidad conceptual y lógica, su sustento empírico, y sobre todo el realismo de sus propuestas finales, por ello se propone como objetivo del artículo defender y argumentar que ambas propuestas metodológicas representan una continuidad y constituyen una inapreciable ayuda para cimentar el juicio clínico de los médicos y favorecer la toma de decisiones de importancia clínica en el contexto de una relación médico-paciente a la altura de las circunstancias científicas y éticas actuales(AU)

The doctor in clinical practice, attends with frustration the absence of a uniform and standardized methodology, to process the great avalanche of clinical data. He is involved in a decision-making process in conditions of uncertainty. There are no illnesses but sick people. The unconscious of the medical thought, seems to want to express the extreme individual variability, which observes in the clinical practice, as well as the uncertainty that accompanies it against the supposed security of the diagnostic and therapeutic rules. Precision medicine and medicine based on evidence, were born with the intention of giving better answers to spaces of uncertainty, to clinical problems from different areas of medicine such as genomics or big data. Both increase the ability to offer the most appropriate intervention to obtain the best result in terms of survival, complications and cost-effectiveness for each patient profile based on their biometric characteristics. The postulates of precision medicine and evidence-based medicine will be under permanent scrutiny of the scientific community in relation to: its conceptual and logical rationality, its empirical sustenance, and above all the realism of its final proposals, for that reason it is proposed as an objective of the article to defend and argue that both methodological proposals represent a continuity and constitute an invaluable aid to base the clinical judgment of physicians and favor the decision making of clinical importance in the context of a doctor-patient relationship at the height of the current scientific and ethical circumstances(AU)

Cambios en el perfil proteómico de preadipocitos con diferentes condiciones metabólicas / Changes in the proteomic pro/ile of preadipocytes with different metabolic status

Resumen Introducción y objetivos: El tejido adiposo subcutáneo se considera un depósito con un papel protector desde un punto de vista metabólico. El exceso de tejido adiposo desencadena en obesidad, la cual, está acompañada típicamente por resistencia a insulina, dislipidemia, e hipertensión arterial. No obstante, se conoce que existe un subgrupo de obesos que parecen estar protegidos de dichas complicaciones. Estos individuos son definidos como obesos sanos metabólicamente. A pesar de los avances en el conocimiento de las alteraciones que suceden en el tejido adiposo en obesidad, aún se desconocen los mecanismos que subyacen en el desarrollo de resistencia a insulina. Por lo tanto, en este trabajo, se estudió la asociación entre obesidad y desarrollo de enfermedad metabólica identificando factores y procesos que determinan la transición desde el fenotipo obeso sano y no sano, empleando preadipocitos provenientes de tejido adiposo subcutáneo. Metodología: Se emplearon datos de un estudio de proteómica comparada de preadipocitos de tejido subcutáneo obtenidos de pacientes obesos normoglucémicos no resistentes a insulina y de pacientes obesos con diabetes mellitus de tipo 2. El estudio proteómico, se llevó a cabo utilizando la técnica de iTRAQ combinada con LC-MSMS. Resultados y conclusiones: Las diferencias entre preadipocitos de tejido adiposo subcutáneo en sujetos normoglucémicos y con diabetes, afectan sobre todo a proteínas citosólicas y, en particular, a proteínas relacionadas con procesos metabólicos mientras que, las membranales no cambian entre fenotipos obesos. En el estudio se identificaron importantes diferencias en el perfil proteómico de los preadipocitos de tejido adiposo subcutáneo en obesidad, tanto en sujetos normoglucémicos como diabéticos, apoyando la importancia de estas células en el mantenimiento de la identidad del depósito graso. También se encontró que, la transición desde el fenotipo obeso sano hacia el no sano conlleva un mayor desarrollo de estrés oxidativo e inflamación en las células precursoras adipocitarias.

Abstract Introduction and objectives: The subcutaneous adipose tissue is considered as a depot with a protective role from a metabolic point of view. An excess of adipose tissue is triggered in obesity, which is accompanied by insulin resistance, dyslipidemia and arterial hypertension. However, it is known that, there is a subgroup of obese people who seem to be protected from obese complications. These individuals are defined as metabolically healthy obese. Despite the advances in the knowledge of the alterations that occur in adipose tissue during obesity, the mechanisms underlying the development of insulin resistance are still unknown. Therefore, in this work, we studied the association between obesity and the development of metabolic disease, we identified factors and processes that determined the transition of healthy and unhealthy obesity phenotype, using preadipocytes from subcutaneous adipose tissue. Methods: Data obtained from a comparative proteomics study of subcutaneous adipose tissue preadipocytes from normoglycemic obese patients-not resistant to insulin and from obese patients with type 2 diabetes mellitus were used. The proteomic study was carried out using the iTRAQ combined with LC -MSMS. Results and conclusions: The differences between pre-adipocytes of subcutaneous adipose tissue in normoglycemic subjects and with diabetes affect mainly cytosolic proteins and, in particular, proteins related to metabolic processes while, membrane proteins do not change between obese phenotypes. In this study, we identified significant differences in the proteomic profile of preadipocytes from subcutaneous adipose tissue in obesity in both, normoglycemic and diabetic subjects, supporting the importance of these cells in the maintenance of the fat depot identity. We also found that, the transition from unhealthy to healthy phenotype in obesity, leads to further development of oxidative stress and inflammation in adipocyte precursor cells.

Aspectos generales del perfil proteómico del Echinococcus granulosus / General aspects of the proteomic profile of Echinococcus granulosus

La información disponible referente a las características proteómicas del E. granulosus es escasa (no supera los 50 estudios publicados); y nos parece que la identificación proteómica, podría mejorar la comprensión de algunas características bioquímicas e inmunológicas de la Equinococosis Quística (EQ). De tal modo que el proteoma de E. granulosus aún no está bien descrito. Sólo existen reportes de algunas secuencias de proteínas. El objetivo de este manuscrito fue comentar algunos aspectos de la evidencia existente respecto de los estudios del perfil proteómico del E. granulosus. Se recomienda el estudio de al menos el quiste y su pared, el líquido hidatídico y la víscera del hospedero. Para ello, existen metodologías que han sido empleadas para estudiar las características proteómicas de la EQ. Entre ellas, destacan SDS-PAGE, electroforesis bidimensional combinada con Western Blot, inmunoanálisis, y espectrometría de masas mediante técnicas MALDI-TOF. Se han identificado una serie de proteínas en muestras de EQ. Algunas de ellas, asociadas a procesos inmunológicos, de gluconeogénesis, glucogenolisis y glucogénesis. Por otra parte, se ha documentado la liberación de exosomas al líquido hidatídico por parte de los protoescólex y la capa germinativa; estructuras en las que se han identificado factores de virulencia asociados con la supervivencia del quiste. No obstante lo anteriormente señalado, se requiere de múltiples estudios exhaustivos en la materia para comprender mejor la caracterización perfil proteómico del E. granulosus.

The information available regarding the proteomic characteristics of E. granulosus is scarce; and it seems that the proteomic identification could improve the understanding of some biochemical and immunological characteristics of cystic echinococcosis (CE). So, the proteome of E. granulosus is still not well described yet. There are only reports of some protein sequences. The objective of this manuscript was to comment on some aspects of the existing evidence regarding studies of the proteomic profile of E. granulosus. The study of at least the cyst and its wall, the hydatid fluid and the viscera of the host are recommended. There are a series of methodologies that have been used to study the proteomic characteristics of EQ. These include SDS-PAGE, bidimensional electrophoresis combined with Western Blot, immunoassay, and mass spectrometry using MALDI-TOF techniques. A series of proteins have been identified in CE samples. Some of them, associated with immune response, gluconeogenesis, glycogenolysis and glycogenesis. On the other hand, release of exosomes to the hydatid fluid by protoescolex and germinative layer has been documented (associated virulence factors have been identified in these structures). Notwithstanding the foregoing, it requires multiple exhaustive studies in the field to better understand the characterization of the proteomic profile of E. granulosus.

Estudio proteómico 2DE-DIGE en plasma sanguíneo de pacientes en etapa infantil con leucemia linfoblástica aguda / 2DE-DIGE proteomic study in blood plasma of patients in childhood stage with acute lymphoblastic leukemia / Estudo proteômico 2DE-DIGE no plasma sanguíneo de pacientes em estágio infantil com leucemia linfoblástica aguda

Resumen En Colombia, durante la última década, la leucemia linfoblástica aguda (LLA) ha causado más del 40% de las muertes por cáncer en menores de edad. Entre los factores que influyen en estas cifras, el diagnóstico tardío es uno de los factores que más afecta el éxito del tratamiento. Por lo anterior, esta investigación se centró en el estudio del proteoma plasmático de niños colombianos diagnosticados con LLA tipo B, en comparación con controles en la búsqueda de proteínas que podrían ser clasificadas como biomarcadores de diagnóstico. En vista de los avances en las herramientas proteómicas y de espectrometría de masas y teniendo en cuenta que son una alternativa para abordar la complejidad molecular de enfermedades como el cáncer, se utilizó una aproximación proteómica basada en una separación por electroforesis bidimensional diferencial (2DE-DIGE) con posterior separación por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) en tándem. Se encontraron ocho proteínas con expresión diferencial en plasma de pacientes con LLA-B, entre las cuales resaltan la Serotransferrina, la Alfa-1-antitripsina, la Haptoglobina, la Alfa-2-glicoproteína de zinc y el Complemento C3.

Abstract In Colombia, during the last decade, acute lymphoblastic leukemia (ALL) has caused more than 40% of cancer deaths in children. Among the factors that influence these figures, late diagnosis is one of the factors that affects the treatment success. Therefore, this research focused on the plasma proteome study of Colombian children diagnosed with B-cell ALL, as compared with healthy controls in the search of proteins that could be classified as diagnostic biomarkers. Now, in view of the advances in the proteomics and mass spectrometry tools and taking into account that they are an alternative to address the molecular complexity of diseases such as cancer, a proteomic approach, based on bidimensional difference gel electrophoretic separation (2DE-DIGE) coupled to LC-MS/ MS, was used. We found eight differentially expressed proteins in plasma from B-cell ALL patients as follows: Serotransferrin, Alpha-1-antitrypsin, Haptoglobin, Zinc-alpha-2-glycoprotein, and Complement C3.

Resumo Na Colômbia, durante a última década, a leucemia linfoblastica aguda (LLA) tem sido o câncer com maior incidência, com mais de 40% das mortes por câncer em menores atribuídas a essa doença. Entre os fatores que influenciam esses números, o diagnóstico tardio talvez seja o fator mais sensível que afeta negativamente o sucesso do tratamento. Esta pesquisa enfocou o estudo do proteoma plasmático de crianças colombianas diagnosticadas com LLA tipo B, dada a sua alta incidência, em comparação com controles na busca por proteínas que poderiam ter potencialidade para serem classificadas como biomarcadores diagnósticos. Agora, em vista dos avanços nas ferramentas de proteômica e espectrometria de massa e sabendo que eles são uma alternativa para abordar a complexidade molecular de doenças como o câncer, usamos uma abordagem proteômica baseada em uma separação por eletroforese bidimensional diferencial (2DE-DIGE) com subsequente separação por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem. Encontramos 8 proteínas com expressão diferencial no plasma de pacientes com LBA, dentre os quais a Serotransferrina, a Alfa-1-antitripsina, a Haptoglobina, a Glicoproteína alfa-2-zinco e o Complemento C3.

Caracterização fenotípica pela técnica de MALDI-TOF de Staphylococcus coagulase negativa isolados de mastite bovina em rebanhos leiteiros do Sul de Minas Gerais / Phenotypic characterization by the MALDI-TOF technique of Staphylococcus coagulase negative isolated from bovine mastitis in dairy herds of the South of Minas Gerais

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus coagulase negativa em leite de vacas leiteiras com mastite por testes fenotípicos e pela técnica de MALDI-TOF MS. Foram utilizadas 85 isolados de estafilococos provenientes de leite de vacas com mastite. Todos os isolados foram caracterizados fenotipicamente por avaliação da morfologia das colônias, coloração de Gram, testes de oxidase, catalase e coagulase. Posteriormente, foram analisados os espectros de proteínas gerados no MALDI-TOF MS, seguida pela separação e detecção de íons pelo tempo de voo (TOF).Foram identificadas sete espécies, sendo a de maior ocorrência S. chromogenes 65 (76%), seguida por, S. hyicus 5 (6%), S. epidermidis 4 (5%).A técnica de MALDI-TOF demonstrou-se efetiva na caracterização de espécies de Staphylococcus causadores de mastite bovina.

Differences in protein expression associated with ivermectin resistance in Caenorhabditis elegans / Diferenças na expressão de proteínas associadas à resistência à ivermectina em Caenorhabditis elegans

Abstract The indiscriminate administration of synthetic anthelmintics such as ivermectin contributes to the selection of subpopulations capable of resisting the drugs' effects. To understand the mechanisms of ivermectin resistance in Caenorhabditis elegans, this study attempted to identify molecular targets. C. elegans lineages that were sensitive and resistant to ivermectin were used. Collected nematodes were added to an extraction buffer and macerated in liquid nitrogen for protein extraction. The extracted proteins were separated according to molecular weight by SDS-PAGE to verify their integrity. Subsequently, proteins from both lineages were separated using two-dimensional electrophoresis. The gels were analyzed and the relevant spots were excised and identified by mass spectrometry (NanoESI-Q-TOF and MASCOT®) and subsequently assessed by GO enrichment and STRING® analyses. The increased expression of proteins associated with high metabolic activity, such as ATP-2 and ENOL-1, which are responsible for ATP synthesis, was observed. Furthermore, proteins with involvement in mediating muscular function (MLC-1, ACT-1, and PDI-2), signaling (FAR-1 and FAR-2), and embryo development (VHA-2) were identified. Protein interaction analysis indicated that the majority of the identified proteins in the resistant lineages participated in the same reaction triggered by ivermectin.

Resumo A administração indiscriminada de anti-helmínticos sintéticos, como a ivermectina, contribui para a seleção de subpopulações capazes de resistir ao efeito das drogas. Para entender os mecanismos de resistência à ivermectina em Caenorhabditis elegans, este estudo visou identificar alvos moleculares. Portanto, linhagens de C. elegans sensíveis e resistentes à ivermectina foram utilizadas. Os nematóides coletados foram adicionados ao tampão de extração e macerados em nitrogênio líquido para obtenção das proteínas. As proteínas extraídas foram separadas por peso molecular em SDS-PAGE para verificar sua integridade. Posteriormente, as proteínas de ambas as linhagens foram separadas por eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados, os spots relevantes foram excisados e identificados por espectrometria de massa (NanoESI-Q-TOF e MASCOT®), em seguida, analisados ​​em seus termos de GO e STRING®. A expressão aumentada de proteínas associadas à alta atividade metabólica, como as proteínas ATP-2 e ENOL-1, responsáveis ​​pela síntese de ATP, foi observada. Além disso, foram identificadas as proteínas responsáveis ​​pelo controle da função muscular (MLC-1, ACT-1 e PDI-2), sinalização (FAR-1 e FAR-2) e desenvolvimento embrionário (VHA-2). A análise das interações proteicas indicou que a maioria das proteínas identificadas na cepa resistente participa da mesma reação desencadeada pela ivermectina.

Development and standardization of a western blotting test for detection of antibodies against B. abortus / Desenvolvimento e padronização do teste Western blotting para detecção de anticorpos contra B. abortus

Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella spp. with diagnosis based on use of serological techniques. The present study aimed to develop and standardize a western blotting (WB) test for detection of antibodies against B. abortus. Samples from two groups of cattle were analyzed: group I: 60 serum samples from true positive and true negative vaccinated animals (30 positive samples from infected animals according to rose bengal test (RBT), 2-mercaptoethanol, serum agglutination test (SAT) and complement fixation test (CFT) and 30 RBT negatives samples); group II: 383 field samples (90 positive and 293 CFT negative sera). The most reactive band in the western blotting, which properly identified and separated infected from non - infected had a molecular weight of ≤ 20kDa. The sensitivity, specificity and accuracy of the WB compared to RBT was 93%, 99%, 98%, respectively and k= 0.938. When compared to CFT, the sensitivity, specificity and accuracy of the WB was 97%, 98% and 97%, respectively and k= 0.929. The WB developed and standardized in the present study is a serological test with potential use as a confirmatory test for the diagnosis of bovine brucellosis.(AU)

A brucelose é uma doença infectocontagiosa, causada por bactérias do gênero Brucella spp., com diagnóstico baseado no emprego de técnicas sorológicas. Objetivou-se neste estudo desenvolver e padronizar um teste Western blotting (WB) para detecção de anticorpos contra B. abortus. Foram analisados dois grupos de amostras bovinas: grupo I, com 60 amostras de animais verdadeiros positivos e verdadeiros negativos vacinados (30 amostras positivas de animais infectados e positivos nos testes de antígeno acidificado tamponado (AAT), 2 - mercaptoetanol (2 - ME), soroaglutinação lenta em tubos (SAT) e fixação do complemento e de 30 amostras negativas no AAT); grupo II, com 383 amostras de campo, sendo 90 soropositivas e 293 soronegativas no TFC. O resultado da análise do WB revelou peso molecular ≤20kDa como sendo a área mais reativa e característica para identificação e separação dos animais infectados dos não infectados. A sensibilidade, a especificidade e a acurácia do WB, quando este foi comparado com o AAT, foram, respectivamente, 93%, 99% e 98%, e k= 0,938. Quando comparadas com a TFC, a sensibilidade, a especificidade e a acurácia foram 97%, 98% e 97%, respectivamente, e k= 0,929. O WB padronizado neste estudo mostrou-se um teste sorológico com potencial uso como teste confirmatório no diagnóstico da brucelose bovina.(AU)